style="width:3.21322in;height:0.70686in" /> … … … … … … … … … …(B. 1) 本文是学习GB-T 33417-2016 过氧化氢气体灭菌生物指示物检验方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验方法。
本标准适用于过氧化氢气体灭菌生物指示物的检验。
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GB18281.1 医疗保健产品灭菌 生物指示物 第1部分：通则
GB/T 24628 医疗保健产品灭菌 生物与化学指示物 测试设备
消毒技术规范(2002年版) 卫生部
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
生物指示物 biological indicator;BI
对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力，并装在内层包装中可供使用的染菌载体。
3.2
过氧化氢气体灭菌 hydrogen peroxide vapour
sterilization
以汽化的过氧化氢作为主要杀灭微生物因子的灭菌方式。
3.3
载体 carrier
试验微生物的支持物。
3.4
存活时间 survival time;ST
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部有菌生长的最长作用时间。
3.5
杀灭时间 killing time;KT
测定生物指示物抗力时，受试样本经杀菌因子作用后，全部无菌生长的最短作用时间。
3.6
D 值 D value
杀灭微生物数量达到90%所需要的时间。
3.7
自含式生物指示物 self-contained biological indicator
含有微生物复苏生长所需培养基的生物指示物。
GB/T 33417—2016
3.8
生物指示物抗力测试仪 biological indicator evaluator
resistometer
产生限定条件下灭菌过程中物理变化规定组合，以测量抗力的专用设备。
用于制作过氧化氢气体灭菌生物指示物的菌株为嗜热脂肪杆菌芽孢(Geobacillusstearothermophilus
ATCC7953 或 SSIK31) 或被证明具有本标准所要求的同等性能的微生物。
回收菌量大于或等于1×10⁶ CFU/
片，对于成品的指示物，载体回收的菌量与说明书上的菌量误差
在-50%～+300%之间。测定菌量时，应最少测试4个样本，具体检测方法参见附录
A。
测试时应使用生物指示物抗力测试仪，生物指示物抗力测试仪要求见 GB/T
24628。 在使用浓度 为59%±2%过氧化氢，灭菌舱内作用浓度为2.3 mg/L±0.4
mg/L,作用温度50℃±0.5 ℃的条件下， D 值的要求为0.75 s~8s。
对于成品的生物指示物，测试的D 值应在说明书上的D 值±20%范围内。
应使用下列2种方法进行测试：
a) 部分阴性法测试D 值，参见附录B;
b) 验证法测试D 值，将 a)测试出的D
值和4.1.2的回收菌量的平均数带入式(1)和式(2),计算
出 ST 值和 KT 值。参见附录C。
ST≥(logN。 -2)×D 值 (1)
KT≤(logN。+4)×D值 ( 2)
式中：
N。 — 每批生物指示物的回收菌量的平均数。
按 GB18281.1 的要求进行灭菌过程兼容性的测试。
a) 有使10 CFU～100 CFU 的微生物恢复生长的能力；
b)
有使损伤的微生物恢复生长的能力，并且有中和残留的灭菌因子对微生物抑制生长的能力；
c) 经过过氧化氢气体灭菌后不会产生抑制微生物生长的物质。
每个样本的恢复培养基中，接种10 CFU～100 CFU
的嗜热脂肪杆菌芽孢(ATCC7953), 同时设置
阴性对照和阳性对照，培养至规定时间后观察有无嗜热脂肪杆菌芽孢生长(一般观察培养基的颜色变
化)。如果恢复培养基有菌生长，并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长，判断恢复培养液合格。
GB/T 33417—2016
取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下，存放至标签和说明书规定的有
效期限，取出再次进行评价，生物指示物应符合4.1、4.2和4.3的要求。
GB/T 33417—2016
(资料性附录)
活菌培养计数方法
A.1 取含有10 mLTPS(0. 1%
胰蛋白胨的生理盐水溶液)的无菌试管，加入适量无菌玻璃珠，将计数菌
片投入试管，用电动混合器混合，到菌片被完全打碎，制成菌悬液。
A.2 将试管按需要数量分组排列于试管架上，每管加入4.5 mLTPS。
各组由左向右，逐管标上10-1、
10-2、10-3……等。
A.3 将菌悬液样本用电动混匀器混合20 s,
或在手掌上用力振打80次，随即吸取0.5 mL 加至10- 1
管内。
A.4 将10⁻ 1管依前法用电动混匀器混合20 s,
或在手掌上用力振打80次，混匀，再吸取出0.5 mL 加
入10-2管内。如此类推，直至最后一管。必要时，还可作某稀释度的1:1或1:4稀释。
A.5 选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15 CFU～300
CFU者为宜),吸取其中混合均
匀的悬液1.0 mL 加于无菌平皿内。每一稀释度接种2个平皿。
一般需接种2个～3个不同稀释度。
A.6
将熔化的40℃~45℃嗜热脂肪杆菌芽孢恢复培养基，见《消毒技术规范(2002年版)》,倾注于已
加入样液的平皿中，每平皿15 mL～20 mL。
A.7
将平皿盖好，即刻轻轻摇动混匀，平放。待琼脂凝固后，翻转平皿使底向上，置56
℃±2℃恒温培
养箱内培养。
A.8 培养至72 h,计数菌落数。
一般以肉眼观察，必要时用放大镜检查。以每平板菌落数在30 CFU~
300 CFU 的稀释度为准记录结果。
A.9
根据稀释倍数和接种量计算每毫升菌液中或每一菌片(染菌载体)上的平均菌落数。
GB/T 33417—2016
(资料性附录)
部分阴性法计算 D 值
B. 1 随机选取120个样本。分成6组，每组20个样本。
B.2 生物指示物抗力测试仪设置如下：
a) 暴露温度：50℃±0.5℃;
b) 暴露剂量：2.3 mg/L±0.4 mg/L;
c)
暴露时间至少为6个时间点，至少1个时间点全部有菌生长，至少2个时间点部分有菌生长，
至少2个时间点全部无菌生长。
B.3 对6组样本分别暴露。
B.4
暴露完成后将6组生物指示物在56℃±2℃温度下，按照说明书要求培养到规定时间，记录阴性
和阳性结果。当最短暴露时间点全部为阳性，最长的2个暴露时间全部为阴性，并且中间至少2组有部
分样本阳性，试验结果有效，带入式(B. 1) 和式(B.2) 计算 D 值。
B.5 部分阴性法(Limited Spearman-Karber 法 )D 值的计算见式(B. 1)
、式(B.2):
style="width:3.21322in;height:0.70686in" /> … … … … … … … … … …(B. 1)
style="width:2.75333in;height:0.64658in" /> ………… … ……… (B.2)
式中：
UHsk——达到无菌生长平均时间，单位为秒(s);
Uk — 首次显示所有样本无菌生长的暴露时间，单位为秒(s);
d —— 暴露时间的固定间隔，单位为秒(s);
n —— 每组的样本量，单位为个；
r; — 每次暴露无菌样本数量，单位为个；
N。 — 回收菌落数，单位为 CFII.
GB/T 33417—2016
(资料性附录)
验证法测试D 值
C.1 ST 值验证
将50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3
mg/L±0.4 mg/L, 在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的ST
值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于
56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部有菌生长，则计算的 ST
值通过验证；若有样本无菌生长，
则计算的ST 值没有通过验证。
C.2 KT 值验证
将50个试验样本放入过氧化氢气体生物指示物抗力测试仪中，作用浓度为2.3
mg/L±0.4 mg/L, 在50℃±0.5℃时，暴露时间设定为计算出的 KT
值，暴露完成后，将50个生物指示物样本取出，置于
56℃±2℃培养至说明书规定时间。若全部无菌生长，则计算的 KT
值通过验证；若有样本有菌生长，
则计算的 KT 值没有通过验证。
C.3 判 定
计算的ST 值和 KT 值都通过验证，则判定测出的D 值有效。
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